miRNA+PI3K/Akt经典套路“攻克”白血病耐药山头

作者:SCI医学论文发表 发表于:2017-07-07   点击:

原创:2017-07-06 HelixLife 解螺旋   转载请注明:解螺旋·临床医生科研成长平台

慢性骨髓白血病(CML)主要致病因素是BCR-ABL酪氨酸激酶的持续活化。虽然临床上治疗手段已有大幅提高,但是化疗抵抗目前仍然是普遍存在的问题。因此,在慢性骨髓白血病治疗上,寻找新的治疗策略是急需的。

 

MicroRNAs作为非编码RNA的排头兵,在各类肿瘤癌症中都有较多研究,其在白血病的研究中也多有涉及。PI3K/Akt通路是经典的耐药通路,在非小细胞肺癌耐药机制研究中占有重要地位。

 

但是PI3K/Akt通路在白血病耐药研究中并不多见。今天米粒儿跟大家分享一篇miRNA联合经典耐药通路PI3K/Akt解决白血病耐药问题的研究。

 

题目:Functional screen analysis reveals miR-3142 as central regulator in chemoresistance and proliferation through activation of the PTEN-AKT pathway in CML.(回复20170706可下载文献。)

本文作者采用miRNA表达,miRNA靶点,表型,通路,回复实验和体内验证6个步骤探讨miRNA介导CML耐药机制。

 

(1)作者报道了miR-3142在ADR-抵抗的K562/ADR细胞和CML患者外周血中过表达。

(2)通过数据库预测方法初步确定靶点PTEN,并采用双荧光报告实验等手段验证数据库预测结果。

(3)在表型实验阶段,分别过表达和沉默miR-3142,检测细胞增殖能力和对ADR敏感性。

(4)在表型实验基础上,引入PI3K/AKT通路,探讨miR-3142表达对PI3K/AKT通路影响。

(5)通过rescue实验,进一步验证miR-3142靶向PTEN影响细胞增殖能力和对ADR敏感性。

(6)体内实验验证miR-3142影响肿瘤增殖。

 

这篇论文涵盖组织,细胞、分子、动物4个水平,涉及分子(miRNA), 通路(PI3K/Akt),靶点(PTEN),并且验证实验之多几乎是miRNA研究的顶级配置,这是发在Cell Death and Disease(IF=5.965)的底气所在。

 

然而米粒儿还是想从鸡蛋里挑点儿骨头。这篇论文从数据呈现方式上还可以进一步改进。众所周知,PTEN是PI3K/Akt的上游分子,本文作者在Step 2展示靶点PTEN后, 在Step4顺理成章的引出PI3K/Akt通路。从说理角度来讲,数据呈现方式合理。

 

但是却割裂了靶点PTEN发现和rescue实验结果,并且将表型穿插在靶点和通路之间,从思路上来讲存在断点,理解稍有困难。如果将顺序改为miRNA表达,表型,通路,miRNA靶点,回复实验和体内验证更有利于读者理解。

 

下边仔细为大家批讲主要内容,读完之后也可以思考一下,如果我自己得到这些数据,会如何呈现给审稿人和读者呢?

作者前期采用miRCURYTM LNA Array对K562和K562/ADR细胞系进行筛选,发现miR-3142在K562/ADR细胞中表达显著升高。作者采用qPCR方法分别在K562,KU812和外周血单核细胞中对上述结果进行验证,结果表明在以上3个体系中,ADR抗性的细胞中miR-3142表达都明显升高。

PTEN是miR-3142靶点

 

作者分别采用TargetScan,PicTar和miRNA.org数据库预测miR-3142的靶点,结果显示PTEN是miR-3142理论上的靶基因。为了验证这一结论,作者采用双荧光报告系统检测miR-3142是否特异性靶向结合PTEN 3’-UTR。

 

结果显示miR-3142转染可显著降低荧光活性。而当PTEN 3’-UTR区域突变后,荧光活性不变,以上结果表明miR-3142可靶向结合PTEN。

 

紧接着,作者在CML患者和CML细胞中分别检测PTEN表达水平。在CML患者和CML细胞中,PTEN表达量都显著降低。且miR-2142与PTEN的表达量呈现明显的负相关。此外,作者分别转染miR-3142和Anti3142,发现miR-3142显著降低PTEN水平,而Anti3142可增加PTEN水平。

 

miR-3142高表达增强抗药性,促进细胞增殖

 

miR-3142高表达细胞中,IC50显著增加,凋亡比例降低。凋亡相关分子cleaved caspase和cleaved PARP表达量降低。OD值增加,克隆形成能力增强。

而当转染Ant3142,即miR3142表达降低后,实验结果与上述相反。

PI3K/AKT信号通路参与miR-3142调节的耐药和细胞增殖调节

 

Akt是PTEN重要的下游分子且参与肿瘤发展,细胞生存和增殖调节。外源表达miR-3142之后,p-Akt表达上升,而敲除miR-3142之后,p-Akt表达下降。

 

此外,作者还检测了PTEN下游通路基因p21,p27等的表达。结果显示miR-3142过表达时,p21,p27表达下降,而cyclin D1表达升高。在miR-3142敲除的细胞中,实验结果刚好相反。

 

而当采用Akt抑制剂LY294002或者shAkt技术干扰Akt表达之后,细胞增殖能力降低,凋亡比例升高,克隆形成能力降低。

 

以上结果表明,miR-3142通过激活PI3K/AKT通路调节药物抗性和细胞增殖。

此外,为了探寻PTEN表达抑制是否对miR-3142引发的细胞生存有重要影响。作者分别在K562/ADR中转染了PTEN质粒和敲除PTEN,结果显示PTEN过表达之后,抑制细胞增殖,药物敏感性增加。而敲除PTEN后,效应相反。

进一步的,在miR-3142过表达的细胞中,重新表达PTEN后可抑制细胞增殖,提高凋亡比例。相反的在miR-3142沉默的细胞中,敲除PTEN后,可促进细胞增殖,降低凋亡比例。这些数据表明,miR-3142调节的药物抗性和细胞增殖中,PTEN表达下降发挥重要作用。

体内实验验证miR-3142影响生长

 

 

为了进一步验证miR-3142对CML细胞药物敏感性和细胞增殖能力的影响,作者进行了动物实验。在miR-3142低表达的Anti3142组,肿瘤体积明显降低。而且Anti3142和ADR联合处理组,肿瘤增殖能力大大抑制。Anti3142组中,肿瘤重量也明显降低。

 

此外,Anti3142组中Ki67表达下降。而且PTEN表达水平升高。这些结果均表明抑制miR-3142可抑制肿瘤增殖。

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